由于配对Cas9-sgRNA的在靶点上的切割间距可以设置为移码的3n+1或3n+2碱基对（n为0或大于0的整数），高效的精准型NHEJ理论上可以帮助提高移码突变频率。为了明确配对Cas9-sgRNA策略在基因敲除（即移码突变）中是否比传统的CRISPR/Cas9方案更有效，作者将编辑中产生的四种NHEJ产物（即上述的Group I、II、III和IV产物）进行重新归类和计算，比较这些产物对移码突变效率的影响。配对Cas9-sgRNA策略（即“Paired”策略）最理想状态只产生Group I产物（即“Ideal”），而传统的双sgRNA基因敲除技术（即“Common”策略）没有Group I NHEJ，只是Group II、III和IV事件的总和（图4a）。通过对其中50个产生移码突变的位点进行分析，作者发现，一旦精准型NHEJ频率超过29.8%，“Paired”策略比“Common”策略在移码突变编辑时更有效，而且，1.85经典传奇，精准型NHEJ频率越高，移码突变频率提高的越高，但都低于“Ideal”状态（图4b）。考虑到绝大部分位点的精准型NHEJ效率都超过29.8%，可以认为配对Cas9-sgRNA策略总体上比传统基因敲除技术更有优势。同时，由于特定长度精准删除的基因敲除产物将增加，基因敲除的同质性也随之提高，这有利于挑选等位基因精准移码突变的细胞克隆。
图4.配对Cas9-sgRNA技术可以提高基于移码突变的基因敲除编辑。a. 配对Cas9-sgRNA编辑产物分组示意图。配对Cas9-sgRNA编辑产物可分成最理想的“Ideal”、传统策略“Common”和配对策略“Paired”三组。标注的Group I、II、III及IV分布于各组。b. 精准型NHEJ频率与移码突变效率正相关。c. 基于精准型NHEJ的“3n+2”碱基对删除，而不是“3n+1”碱基对删除，在平均水平上可提高移码突变频率。
此外，当配对Cas9-sgRNA的切割间距设置为3n+1碱基对时，高频的+1核苷酸模板化插入会将3n+1的移码突变转变为3n的整码突变，基因敲除效率会因此受影响。然而，如果配对Cas9-sgRNA的切割间距为3n+2时，即使高频的+1核苷酸模板化插入也只是将3n+2的移码突变转变为3n+1，移码突变的效率不受影响，配对Cas9-sgRNA基因敲除技术的效果仍优于传统CRISPR/Cas9基因敲除技术（图4c）。
基因编辑中也常应用到整码删除或整码突变，比如整码删除基因的特定功能区域。既然配对Cas9-sgRNA的切割间距可以设置为3n碱基对（n为大于0的整数），是否可以利用高效的精准型NHEJ修复实现高效精准的整码删除呢？作者于是分析了配对Cas9-sgRNA策略介导的20个整码突变位点。结果显示，传统基因编辑技术（即“Common”技术）将整码突变效率维持在33%左右，而“Paired”配对策略明显优于“Common”技术（图5）。其介导的整码突变效率还随着精准型NHEJ频率的提高而提高（图5）。其中的主要编辑组分是精准整码删除，同质性明显得以改良，这便于挑选等位基因精准整码删除的细胞克隆。
图5. 配对Cas9-sgRNA技术可以提高整码突变的编辑效率。
为了提高精准型NHEJ，帮助配对Cas9-sgRNA的基因编辑效果，本文还报道了一个可以提高精准型NHEJ效率的小分子化合物——Plk3的小分子抑制剂GW843682X（图6a）。通过抑制Plk3介导的末端加工酶CtIP的磷酸化，该抑制剂可以阻碍末端加工，提高精准型NHEJ效率[5]。通常，精准型NHEJ的提高是以牺牲总编辑效率为代价的，有时总体上并不利于精准基因编辑。庆幸的是，GW843682X不仅不降低总编辑效率，反而提高（图6b）。这为提高配对Cas9-sgRNA的基因编辑效果提供了一个可以化学改良的机会。
图6. Plk3抑制剂GW843682X可以提高配对Cas9-sgRNA工作效能。a. Plk3抑制剂提高精准型NHEJ效率。b. Plk3抑制剂提高Cas9-sgRNA的总编辑效率。
基于配对Cas9-sgRNA编辑特征，作者提出相应的基本操作流程及该技术需要遵循的几个原则（图7）:1）需要从针对特定基因组靶点的多个sgRNA中快速筛选出有效的配对sgRNA；2）该技术适用于基因组DNA短片段删除，本文所测试的长度主要集中在12-148碱基对之间；3）配对Cas9-sgRNA 的PAM方向组合尽量选择W/C以避免高频的模板化插入；4）移码突变时配对Cas9-sgRNA切割间距设置为3n+1或3n+2碱基对（n为0或大于0的整数），但为避免高频的+1核苷酸模板化插入，尽量选择3n+2碱基对；5）整码突变时配对Cas9-sgRNA切割间距设置为3n碱基对（n为大于0的整数）；6）必要时可以利用Plk3的小分子抑制剂GW843682X提高基因编辑效果。
图7. 利用配对Cas9-sgRNA编辑策略进行基因编辑的流程图及需要遵循的原则。
本文中，配对Cas9-sgRNA技术被用于DNA损伤应答因子MDC1的精准移码删除（即精准基因敲除）以及53BP1的寡聚结构域（oligomerization domain，OD）和Tudor结构域的精准整码删除。作者从中获取等位基因精准编辑的细胞克隆，分析基因及对应结构域的功能，验证了配对Cas9-sgRNA基因编辑技术的应用潜力。随着PAM相容性的拓展，配对Cas9-sgRNA策略可以应用到更多的基因组靶点，应用将更广泛。
上述研究成果于10月19日于Genome Biology在线发表，题目为“Harnessing accurate non-homologous end joining for efficient precise deletion in CRISPR/Cas9-mediated genome editing”。浙江大学医学院附属邵逸夫医院及转化医学研究院谢安勇教授和浙江大学医学院附属邵逸夫医院蔡秀军教授为本文共同通讯作者，实验室博士生郭涛和助理研究员冯依力为共同第一作者。该研究由国家自然科学基金委、浙江省自然科学基金委、浙江省科技厅项目基金资助。